文獻內(nèi)容講解

巨自噬（以下簡稱自噬）涉及膜的初始形成，將細胞質(zhì)中需要分解的物質(zhì)隔離形成雙膜自噬體，自噬體隨后與溶酶體接觸，進而融合，從而使物質(zhì)分解和由此產(chǎn)生的大分子循環(huán)，以在饑餓和細胞應(yīng)激期間獲得穩(wěn)態(tài)。

自噬體的生物發(fā)生通過ULK1激酶復合物和III類磷脂酰肌醇3激酶復合物1(PIK3C3-C1)聚集到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)相關(guān)位點啟動，新形成的自噬體即從這些位點發(fā)出。自噬體膜很大程度上缺乏跨膜蛋白，因此認為其形成受膜相關(guān)蛋白及其脂質(zhì)組成和分布的調(diào)節(jié)。

前人研究表明，自噬體富含不飽和脂肪酸，而這些脂肪酸是自噬體形成所必需的。這些研究表明，降低膜序有利于自噬的啟動，可能是通過產(chǎn)生已知的自噬體形成所需的柔性高度彎曲的膜。除了磷脂、膽固醇是哺乳動物膜的一個重要組成部分，它的豐度也是膜秩序和流動性的決定因素。

細胞內(nèi)膽固醇水平通過生物發(fā)生和細胞外膽固醇攝取進行雙重調(diào)節(jié)。除了低密度脂蛋白受體(LDLR)途徑外，一些膽固醇轉(zhuǎn)運蛋白也被證明直接從質(zhì)膜(PM)介導膽固醇的輸入和胞內(nèi)轉(zhuǎn)運。這種膽固醇轉(zhuǎn)運蛋白例如 GramD 家族蛋白（由GramD1A、GramD1B、GramD1C（也稱為ASTER蛋白）、GramD2和GramD3)，以其N-末端區(qū)域的脂質(zhì)結(jié)合PH相似結(jié)構(gòu)域命名。在這5個成員中，只有GramD1A、GramD1B和GramD1C（這里統(tǒng)稱為GramD1S)含有一個與甾醇結(jié)合的巨大結(jié)構(gòu)域，允許它們促進PM到ER膽固醇的輸入。

GramD1S的缺失導致細胞膜中可及膽固醇的積累,而GramD1A和GramD1B缺失的小鼠巨噬細胞也表現(xiàn)出甾醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白2(SREBP2)靶基因的上調(diào)表達，表明ER膽固醇降低。由于對GramD家族蛋白質(zhì)的研究數(shù)量有限，它們的生物學重要性仍未深入了解。

膽固醇耗竭促進自噬啟動

此項研究用快速清除細胞膜中膽固醇的MBCD分析了膽固醇耗盡后饑餓誘導的自噬的短期影響。對照細胞相比，在基礎(chǔ)條件下，膽固醇耗竭導致LC3B(LC3B-II)的膜結(jié)合形式增加了三倍，這在缺乏膽固醇的饑餓細胞中進一步增強；據(jù)內(nèi)源性LC3B點狀體的免疫熒光顯微鏡觀察，膽固醇耗竭增加了Fed和Starved細胞中自噬體的形成。這些結(jié)果表明，膽固醇耗竭促進自噬誘導，并增強饑餓誘導的自噬。

為了闡明細胞膽固醇調(diào)節(jié)劑是否也影響自噬，設(shè)計實驗耗竭在膜接觸點作為非泡狀細胞器間膽固醇運動中介的膽固醇轉(zhuǎn)運蛋白。鑒于復合物通過其C端區(qū)域22和GramD1A參與自噬，為明確GramD1A家族的其他成員是否也參與自噬，用siRNA轉(zhuǎn)染穩(wěn)定誘導表達自噬報告基因Mcherry-EGFP-LC3B（黃色自噬體，由于酸性溶酶體中EGFP猝滅而產(chǎn)生的紅自溶酶體）的U2OS細胞，分別耗盡每個Gram家族成員。這些實驗數(shù)據(jù)表明，GramD1C介導的膽固醇轉(zhuǎn)運調(diào)節(jié)饑餓誘導的自噬。

U2OS細胞中GramD1C耗竭導致了幾種早期自噬機制成分的增加，如ATG13、ATG16L1和PTDINs(3)P效應(yīng)蛋白WIPI2B40；而且與膽固醇耗竭細胞中的結(jié)果一致，研究發(fā)現(xiàn)GramD1C耗竭促進饑餓細胞中EGFP-BAT的募集，這些結(jié)果提示GramD1C通過降低膜曲率抑制自噬體的啟動。

為了研究GramD1C是否可能調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體之間的膽固醇運動，我們在分離的線粒體中加入重組Mcherry標記的perfringolysin O(Mcherry-D4)膽固醇結(jié)合域，建立了一種線粒體膽固醇定量方法。后續(xù)通過一系列實驗證明GramD1C是線粒體膽固醇豐度和線粒體生物能量學的負調(diào)節(jié)因子。

Gram家族表達對CCRCC預后的影響

通過TCGA數(shù)據(jù)庫分析腎透明細胞癌(KIRC)腫瘤基因表達數(shù)據(jù)中完整的Gram1C家族在CCRCC中的參與情況，及患者生存的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)GRAMD1C、GRAMD2B是腎透明細胞癌(CCRCC)患者預后的不利因素；Gram家族成員可能是通過調(diào)節(jié)新陳代謝和癌細胞存活率來調(diào)節(jié)CCRCC患者的總存活率。