簡要描述:TUNEL技術可對組織或細胞中凋亡小體或單個凋心細胞進行染色,能準確反映細胞凋亡最典型的生物化學和形態(tài)特征。凋亡細胞內(nèi)內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶被激活而將自身染色體DNA切斷成缺口或3-OH末端片段這一特點,利用脫氧核苷酸末端轉移酶將標有標記物的脫氧核苷酸轉移到3-0H末端,再用免疫組化法或免疫熒光檢測凋亡細胞。上海伊萊博致力于臨床前藥效學CRO實驗,有著多年的TUNEL檢測技術服務的經(jīng)驗
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1.用二甲苯浸洗2次,每次5min;
2.用梯度7醇(100.95.90.80、70%)各浸洗1次,每次3min:注:上面兩步是針對石蠟切片樣木的外理
3.用Proteinase K作液外理組織15 30 min 在21-370(溫度、時間、濃度均需摸索)或者加細胞通透液8min
4.PBS漂洗2次;
5.制備TUNEL反應混合液,處理組用50ulTdT+450ul 熒光素標記的dUTP液混勻;而陰性對照組僅加50ul 熒光素標記的dUTP液,陽性對照組先加入100ul DNase 1,反應在15~25℃x10min,后面步驟同處理組。
6.玻片干后,加50uI TUNEL反應混合液(陰性對照組僅加50u熒光素標記的dUTP液)于標本上,加蓋玻片或封口膜在暗濕盒中反應37℃x1h。
7.PBS漂洗3次;
8. 可以加1滴PBS在熒光顯微鏡下計數(shù)凋亡細胞(激發(fā)光波長為450~500nm,檢測波長為515~565nm);
9.玻片干后加50ul converter-POD干標本上,加蓋玻片或封口膜在暗濕盒中反應37°cx30min.
10.PBS漂洗3次,
11.在組織處加50~100uIDAB底物,反應15~25℃℃x10min;
12.PBS漂洗3次;
13.拍照后再用蘇木素或電其綠復染,幾秒后立即用自來水沖洗。梯度灑精脫水,二電苯透明,中性樹膠封片。
14.加一滴PBS或甘油在視野下,用光學顯微錯觀察凋廣細胞(共計200~500個細胞)并拍照,可結合調(diào)廣細胞形太特征來綜合判斷(未染色細胞變小,胞膜完整但出現(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象,晚期出現(xiàn)凋亡小體,貼壁細胞出現(xiàn)鄒縮、變圓、脫落;而染色細胞呈現(xiàn)染色質濃縮、邊緣化,核膜裂解,染色質分割成塊狀/凋亡小體。
我們擁有專業(yè)的實驗室、精良的實驗設備和經(jīng)驗豐富的科研技術人員。技術團隊包括研究員(博士后)2人,助理研究員(博士)4人,核心研究員(碩士)15人,主要致力于基因組學、轉錄組學、蛋白質組學、代謝組學、生物化學、病理檢測、基因檢測等技術在科研中的應用與推廣。通過高度細分、較好的的服務平臺,為廣大客戶提供了完善的技術解決方案和服務。目前,及,涉及臨床醫(yī)學、腫瘤生物學、免疫學、細胞生物學、分子生物學等生命科學、醫(yī)學等諸多領域。
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